УДК 611.71:616-073+572.087
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МАКРОСКОПИЧЕСКОГО ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО АНАЛИЗА ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ ОСТЕОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА© 2006 г. Меренков В. Г.
Способность коллагена к ультрафиолетовой флуоресценции позволяет контролировать процесс минерализации скелетного материала, и выявить участки кости пригодные для дальнейших биохимических и генетических исследований.
Введение
Макроскопический флуоресцентный анализ позволяет определить степень микробиологического разложения (фоссилизации) археологического и палеонтологического костного материала, что может иметь решающее значение при отборе материала для биохимических и генетических исследований. Метод основан на способности коллагена к фотофлуоресценции - флуоресценции инициированной ультрафиолетовым облучением.
Кость представляет собой сложный композитный материал, состоящий из кристаллов гидроксиапатита, микрофибрилл коллагена и мукополисахаридов, связывающих в единую систему белковый и минеральный компоненты кости. При минерализации (фоссилизации) происходит разложение органического компонента кости и замещение гидроксиапатита апатитом и солями тяжёлых металлов. Так как это процесс происходит при участии сапротрофных бактерий, в фоссилизированных костях могут накапливаться биологические материалы бактериального происхождения.
Коллаген относят к флуоресцентным белкам II класса. Его способность к флуоресценции определяется наличием в структуре ароматических аминокислот: тирозина и фенилаланина. Денатурация флуоресцентных белков всегда сопровождается потерей способности к флуоресценции [3].
При освещении ультрафиолетовой лампой, участки кости, в которых сохраняется вторичная структура коллагена, флуоресцируют ярко-голубым светом, резко контрастиующим как с бурой окраской фоссилизированной кости, так и с нерганическими веществами, дающими тёмно-фиолетовую или красно-фиолетовую флуоресценцию. Степень флуоресценции можно оценить визуально, тли зафиксировать с помощью Фотографичской техники. Исследования целесообразно проводить в темноте, когда флуоресценция более заметна.
Объекты и методы исследований.
Нами было проведено исследование фотофлуоресценции 22 шлифов костной ткани. 16 – из остеологических материалов, полученных при археологических раскопках на территории г. Смоленска, и 6 – из анатомического музея Смоленской государственной медицинской академии. Исследования проводились с помощью диагностического ультрафиолетового осветителя ОЛД-41. Результаты фиксировались цифровой фотокамерой, с дальнейшей обработкой изображений с использованием программы Adobe photoshop v. 5.5 [4]. Параллельно проводилась съёмка шлифов в видимом свете. В связи с полной идентичностью ультрафиолетовых Фотографий шлифов из собрания музея, в работе приводятся лишь 2 из них.
Общий ход фоссилизации кости.
Исследование костных шлифов из музея СГМА (рис. 1, 2) показало полную сохранность коллагена шлифов, что указывает на то, что методы применяемые для анатомической препаровки кости: вываривание, отбеливание и т.д. не приводят к деструкции коллагена.
Рис. 1.
Рис. 2.
При исследовании костного материала их археологических раскопок обнаружилось, что в компактном веществе кости первоначальные центры фоссилизации возникают на поверхности кости со стороны периоста, эндооста и в Гаверсовых каналах (рис. 3, 5) . На первых стадиях преобладает фоссилизация с поверхности эндооста и периоста (рис. 7, 8,13). На последних этапах фоссилизация происходит преимущественно вдоль Гаверсовых каналов (рис. 6, 11).
Сравнительный анализ шлифов.
При сравнительном анализе шлифов (таблица –1) мы посчитали необходимым учесть различия в экологических условиях в местах захоронений, возраст захоронений и возрасте смерти индивидов.
Для упрощения сравнительной оценки, степень оссификации оценивалась нами в баллах:
0 - очаги фоссилизации при макроскопическом исследовании не выявляются.
1 - единичные очаги фоссилизации со стороны эндооста, периоста и крупных Гаверсовых каналов.
3 - образование со стороны эндооста и периоста двух сплошных колец фоссилизированной кости, толщина каждого не достигает толщины компактного вещества кости.
5 - толщина каждого их фоссилизированных колец достигает 1/3 толщины компактного вещества кости.
7 - не фоссилизированный участок кости приобретает сетчатую структуру за счёт образования заметных фоссилизированных участков вокруг Гаверсовых каналов.
9 – остаточные нефоссилизированные участки располагаются по всей окружности шлифа.
11 - на шлифе можно обнаружить несколько отдельных точечных участков нефоссилизированной кости.
13 – полная фоссилизация.
Данная система использовалась нами только с целью избежать громоздких словесных описаний для каждого шлифа.
Традиционная возрастная периодизация [1] :
до 10 дней – новорожденные
11дней – 1 год грудной
1 год – 3 лет раннее детство
3 года – 7 лет I детство
8 - 12 лет II детство
13 – 16 лет Подростковый возраст
17 лет – 21 год Юношеский
22 – 35 лет I зрелость
36 – 59 лет II зрелость
60 – 74 года пожилой возраст
75 – 90 лет старческий возраст;
- не отражает возрастные изменения в структуре длинных трубчатых костей. При оценке результатов исследований нами была использована возрастная периодизация, основанная на исследованиях структуры костной ткани В. Добряка [2] :
0 – до 3 мес. – формирование грубо волокнистой костной ткани
I - 3 мес. – 3 года - смена грубо волокнистой костной ткани
II – 3 года – 8 лет - интенсивный рост кости
III - 8 – 16 лет - окончание дифференциации остеонов
IV - 16 – 25 лет - формирование структуры кости, свойственной взрослому человеку
V - 25 - 35 лет - сохранение структуры кости, свойственной взрослому человеку
VI – 35 – 50 лет - появление признаков остеопороза в проксимальных участках длинных трубчатых костей и постепенное его распространение на медиальные и дистальные участки
VII – более 50 лет - усиление остеопороза по всей длине длинных трубчатых костей.
Общая характеристика захоронений:
Кп – захоронения XVII в. на территории нынешнего городского рынка. Пойменный участок, регулярно затопляемый водой. Захоронения перекрыты толстым культурным слоем;
Бв - захоронение вскрытое у подножия башни Веселуха, относящиеся предположительно – к концу XVII – началу XVIII вв. Располагаются на вершине холма в моренном суглинке с большой примесью извести, битого кирпича и другого строительного мусора.
В таблице указаны кости, из которых были выпилены диски для шлифов:
C - costae
F - femur
f - fibula
R - radius
p - проксимальная часть
m - медиальная часть
d - дистальная часть
Таблица 1
| Рис. | Протокол | Месть захоронения | Кость | Возраст смерти |
Степень фоссилизации |
| 3 | 10 | Кп | f | VI | 3 |
| 4 | 8 | Кп | f | IV | 3 |
| 5 | 12 | Кп | Fd | III | 7 |
| 6 | 12 | Кп | Fm | III | 7 |
| 7 | 12 | Кп | Fp | III | 7 |
| 8 | 16 | Кп | Fd | I | 9 |
| 9 | 16 | Кп | Fm | I | 9 |
| 10 | 16 | Кп | Fp | I | 8 |
| 11 | 5 | Кп | Fd | III | 3 |
| 12 | 5 | Кп | Fm | III | 5 |
| 13 | 5 | Кп | Fp | III | 6 |
| 14 | 6 | Кп | Fd | V | 3 |
| 15 | 3 | Кп | Fd | III | 4 |
| 16 | 3 | Кп | Fm | III | 4 |
| 17 | 3 | Кп | Fp | III | 5 |
| 18 | 21 | Бв | Rm | IV | 2 |
Рис. 3. Рис. 4. Рис. 5. Рис. 6. Рис. 7. Рис. 8. Рис. 9. Рис. 10. Рис. 11. Рис. 12. Рис. 13. Рис. 14. Рис. 15. Рис. 16. Рис. 17. Рис. 18.
Исследованиями была выявлена определённая корреляция между возрастом смерти и степенью фоссилизации костных останков. При повышении возраста смерти до 25-30 лет (мы не располагаем остеологическим материалом с большим возрастом смерти) степень фоссилизации костей несколько снижается.
Можно отметить, что скелет из захоронения у подножия башни Веселуха фоссилизирован в значительно меньшей степени, чем скелеты из захоронений на Колхозной площади. Это может быть вызвано особыми почвенно-георграфическими условиями в этом захоронении.
В четырех случаях (рис. 6-8, 9-11, 12-14, 16-18) была исследована фоссилизация на протяжении всей кости. Не было выявлено достоверных различий фоссилизации проксимальной, медиальной и латеральной частей кости.
Литература:
THE MACROSCOPIC FLUORESCENCE ANALYSIS CAN BE USED AT RESEARCH AN SKELETAL STUFF
Merenkov V. G.
The collagen has an ability to ultra-violet fluorescence. It’s ability allows to supervise process of a mineralization of a skeletal stuff, and to reveal a bone fields applicable for the further biochemical and genetic researches
Кафедра анатомии человека
Смоленская государственная медицинская академия
Поступила в редакцию 16.05.2006.